充分溶解并混勻PCR反應(yīng)所需的各種溶液。將2x 長片段PCR 擴(kuò)增 預(yù)混液（ long fragment PCR Master Mix）置于冰浴上或冰盒內(nèi)。參考下表在冰上設(shè)置PCR反應(yīng)：
| Component | 20uL RXN | 25uL RXN | 50uL RXN | Final Concentration |
| 2x 長片段PCR 擴(kuò)增 預(yù)混液 | 10uL | 12.5uL | 25uL | 1 × |
| 10uM Forward Primer | 0.4uL | 0.5uL | 1.0uL | 0.2uM |
| 10uM Reverse Primer | 0.4uL | 0.5uL | 1.0uL | 0.2uM |
| Template DNA | variable | variable | variable | variable |
| Nuclease-Free Water | to 20uL | to 25uL | to 50uL |
|
2 . 不同模板最佳反應(yīng)濃度有所不同，反應(yīng)體系推薦模板使用量可參見下表。
| Template DNA | 20uLRXN | 25uL RXN | 50uL RXN |
| Genomic DNA | 4ng-0.4ug | 5ng-0.5ug | 10ng-1ug |
| Plasmid or Vrial | 4pg-4ng | 5pg-5ng | 10pg-10ng |
| cDNA | 4pg-0.4ug | 5pg-0.5ug | 10pg-1ug |
3. 用移液器輕輕吹打混勻或輕微Vortex混勻，室溫離心數(shù)秒，使液體積聚于管底。
反應(yīng)程序
1 .退火溫度應(yīng)根據(jù)引物Tm值進(jìn)行調(diào)整(50-72℃)。
2. 延伸時(shí)間需根據(jù)擴(kuò)增片段的長度和復(fù)雜性進(jìn)行調(diào)整。
3. 各設(shè)置好的PCR反應(yīng)管置于PCR儀上，開始PCR反應(yīng)。
| STEP | TEMP | TIME |
| Initial Denaturation | 98°C | 30 sec |
| 25–35 Cycles | 98°C | 10 sec |
| 50–72 °C | 15 sec |
| 72°C | 15-30 sec/kb |
| Final Extension | 72°C | 5 min |
| Hold | 4–10 °C | ∞ |
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